PCR እንዴት ከዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተልና የሴሎች አጉሊዎችን ማሻሻል አለበት
የ polymerase chain reaction ( PCR ) የጂን (gene) ቅደም ተከተል ሂደት ግኝት ለማድረግ ብዙ ሞለኪውላዊ ዝርያዊ ዘዴ ነው.
የ polymerase ቼን ሪውንስ መስራት እንዴት ይሰራል?
የጂን ቅጂዎች የሚዘጋጁት በዲ ኤን ኤ ናሙና በመጠቀም ነው, እና ቴክኖሎጂው ናሙና ውስጥ ከተገኘው አንድ ነጠላ የፒኤን ቅጂ ብዙ ቅጂዎችን ለማዘጋጀት በቂ ነው. የጂን ኤንጂ (PCR) ሚሊዮኖችን ግኝት ለማዘጋጀት በሚሊዮን የሚቆጠሩ ቅጅዎች ዲ ኤን ኤ ቁራጭ (+ ዲ ኤን ኤ) ላይ ባለው መጠን እና ኃይል (+ ወይም -) ላይ በመመርኮዝ የእይታ ውጤቶችን በመጠቀም ለይቶ ማወቅ እና ለይቶ ለማወቅ ያስችላል.
በተቆጣጠራቸው ሁኔታዎች ውስጥ, የዲ ኤን ኤ አነስተኛ ክፍሎች በተመረቱ ዲ ኤን ኤነር (polymerase) የሚባሉ ኢንዛይሞች የሚመነጩት (ዲንሲኒኑዋይድድስ) (dNTPs) ወደ ዲ ኤን ኤ ውስጥ "አብነት" ተብሎ በሚጠራው ዲ ኤን ኤ ውስጥ ይጨምራሉ. አነስተኛ መጠን ያላቸው ዲ ኤን ኤ እንኳ "ፕሪመር" (ፕሪመርስ) ተብለው ይጠራሉ. እርጥበታማዎች በአብዛኛው ሰው-ሠራሽ ዲ ኤን ኤ (ኦሊሞርስቶች) ናቸው, በአብዛኛው ከ 15 እስከ 30 ኒክሊዮታይዶች. የሚባሉት በጂን ጫፎች ላይ የአጭር የዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተሎችን በማወቅ ወይም በግምት በመገመት ነው. በ PCR ወቅት ዲ ኤን ኤ በቅደም ተከተል መደርደር ሲከሰት እና ሁለት እሪች ተለያይተው. በሚቀዘቅዝበት ጊዜ አምሳያዎቹ ከቅንጅቱ ጋር ይጣጣማሉ (አንኒልኬጅ ተብለው ይጠራሉ) እናም ፖሊመቤይ ለመጀመር ቦታ ይፍጠሩ.
The PCR Technique
የ polymerase chain reaction (PCR) የተደረገው thermophiles እና ቴርሞፊል ፖሊመርሬስ ኢንዛይሎች (በከፍተኛ ሙቀቶች ከደረሱ በኋላ መዋቅራዊ አሠራሮችን እና ተግባራትን የሚጠብቁ ኢንዛይሎች) ነው.
በ PCR ቴክኒካዊ ውስጥ የተካተቱት እርምጃዎች እንደሚከተለው ናቸው-
- ድብልቅ የሚፈጠረው በዲ ኤን ኤ ንድፍ, ፖሊሜሬስ ኢንዛይም, እንክብሎች, እና dNTPs ነው. ኤንዛይነሩን ሳይለውጥ ድዳውን ለማሞቅ ችሎታ ያለው የዲኤንኤ ናሙና ናሙና በ 94 ዲግሪ ሴልሺየስ ውስጥ በከፍታ የሙቀት መጠን እንዲለቀቅ ያስችለዋል.
- ናሙናውን ተከትሎ ናሙናውን ወደ 54 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ያቀናበረ ሲሆን ይህም የፀሐፊዎችን ጥርጣሬ ወደ ነጠላ የዲ ኤን ኤ አብነት ቅርጾች ይሠራል.
- በ "ሦስተኛው የ" ዑደት "ናሙና ወደ ሙዳይድ ዲኤንኤ ዲ ኤን ኤ ሞለሚለስ ለመርከቻው እስከ 72 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እንዲመለስ ይደረጋል. በጊዜ ርዝመት, ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬተስ የመጀመሪያውን ነጠላ የዲ ኤን ኤ ክፈልን እንደ አብነት በመጠቀም ጥልቀት ያላቸው ኤን ቲ ቲ ፒዎችን በ 3 ቱም ጫፍ ላይ በማከል እና በወደፍ እርባታ ክልል ውስጥ ሁለት ድርቅ የዲ ኤን ኤ ክፍልን ይፈጥራል.
- የዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተሎች ያልተመዘገቡ የመጀመሪያ ደረጃዎች በ 72 ዲግሪ ተጣብቀው መቆየት የማይችሉ ሲሆን ይህም ወደ ወራጅ ዘረ-መል (ረቂቅ) ማራዘም ነው.
ይህ አጣቃፊ, አጣና እና ዘጋቢነት በተደጋጋሚ በተደጋጋሚ (30-40) ጊዜ ይደጋገማል. በዚህ መንገድ በቅልቅል ውስጥ የተፈለገውን የጂን ግኝቶች ብዛት በሂደት ይጨምራል. ምንም እንኳ ይህ ሂደቱ በሰው እጅ ከተሰራ በጣም ትንሽ ነው, ናሙናዎች በፕሮግራፊነት በሚሠራው Thermocycler, በአሁኑ ጊዜ በአብዛኛው ሞለኪውላዊ ላቦራቶሪዎች ውስጥ የተለመዱ እና ሙሉ የ PCR ምላሾች በ 3-4 ሰዓት ውስጥ ሊከናወን ይችላል.
እያንዳንዱ የውድገት ደረጃ የቀድሞውን ዑደት የማቆም ሂደት ያቆመዋል, ስለዚህ አዲሱን የዲ ኤን ኤ ሽክርክሪት በመቀነስ የተፈለገውን የጂን መጠን ይቀይረዋል.
የማራዘም ዑደት የሚፈጀው ጊዜ በፍላጎት የጂን መጠን መጠን ረዘም ወይም አጭር ሊሆን ይችላል ነገር ግን በተደጋጋሚ በተደጋጋሚ በተደጋጋሚ የ PCR ዑደት አብዛኛው የአብነት ስራዎች ለትክክለኛው የጂን መጠን ብቻ ስለሚገደቡ ብቻ ነው. ከሁለቱም ጠቋሚዎች ውጤቶች ይወጣሉ.
ውጤቱን ሇማሻሻሌ የሚቻሇ የተሇያዩ የ PCR ውጤቶች በርካታ ናቸው. ለ PCR ምርቱ ለመፈተሸል በጣም የተለቀቀው ዘዴ የአጋሮሴል ጀል ኤሌክትሮፊሸሪስ ነው . በማናቸውም መጠን እና ባትሪ በመያዝ መሰረት የዲ ኤን ኤ ቁርጥሮችን ለመለየት ጥቅም ላይ የሚውል ነው. እነዚህ ቁራጭዎች በሚታዩ ማቅለሚያዎች ወይም ራዲዮስቴፖች በመጠቀም ይታያሉ.
ዝግመተ ለውጥ
PCR መገኘቱ ከተለመደው ጀምሮ ከመጀመሪያው ታህግ በስተቀር ሌሎች የዲ ኤን ኤ ፖሊመሬተሮች ተገኝተዋል. ከእነዚህ ውስጥ አንዳንዶቹ የተሻለ የ "የማረም ችሎታ" ችሎታ አላቸው ወይም በከፍተኛ የሙቀት መጠን የበለጠ የተረጋጋ ሁኔታ ስለሚያደርጉ የ PCR ን ልዩነት ያሻሽላሉ እና የተሳሳተውን የ dNTP ማስገባት የሚያስከትሉ ስህተቶችን ይቀንሳል.
አንዳንድ የ PCR ተለዋጮች ለተወሰኑ ትግበራዎች የተነደፉ እና አሁን በሞለኪዩል ጀነራል ላቦራቶሪ ውስጥ በመደበኛነት ጥቅም ላይ ይውላሉ. ከነዚህም መካከል አንዳንዶቹ የእውነተኛ ጊዜ PCR እና Reverse-Transcriptase PCR ናቸው. PCR መገኘት በተጨማሪም የዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተሎችን, ዲ ኤን ኤ የጣት አሻራዎችን እና ሌሎች የሞለኪውላዊ ቴክኒኮችን ለማምጣት ያገለግላል.