የፕሮቲን ንፁህ ዘዴዎች

የባዮቴክኖሎጂ ምርምር አስፈላጊ ክፍል አንዱ ለየት ያሉ የኢንደስትሪ አተገባበርን በመጠቀም ፕሮቲን ለመሥራት ወይም ለመቀየር የፕሮቲን ምህንድስና ዘዴዎችን መጠቀም ነው. ይህን ለማድረግ የሳይንስ ሊቃውንት የተመጣጠነ ቅርጾችን, ተክሎችን መለየት, ከሌሎች አገናኞች ጋር ያሉ ግንኙነቶችን, እና የተወሰኑ ተግባራትን ለመጠቆም ፍላጎት ያላቸውን ፕሮቲኖችን ማስወገድ እና መለየት መቻል አለባቸው.

ፕሮቲን ንጹህ ፕሮቲን (ፕሮቲን ንጹህ) በፕሮቲን በተሠራበት ዓላማ ላይ ይመረኮዛል.

ለአንዳንዶቹ አፕሊኬሽኖች, ደረቅ መፍጨት በቂ ነው. ይሁን እንጂ እንደ ምግቦች እና መድሃኒቶች የመሳሰሉት ለሌላ ጥቅሞች ከፍተኛ የሆነ ንፅህና ያስፈልጋል. ይህንን ብዙ የፕሮቲን የማጣራት ዘዴዎች ለማሳካት በተከታታይ የመንጻት ደረጃዎች ጥቅም ላይ ይውላሉ.

እያንዳንዱ ፕሮቲን የማጣራት ደረጃ ብዙውን ጊዜ የምርት ብክነትን ያስከትላል. ስለሆነም, በጣም ጠቃሚ የሆነ የፕሮቲን የመንጻት ስትራቴጂዎች እጅግ በጣም ጥቂት የመንጻት ደረጃ በደረጃ በጣም ጥቂት ናቸው. የሚጠቀሙት የትኞቹ እርምጃዎች እንደ መጠኑ, ክፍያ, መበታተን እና ሌሎች የታለመው ፕሮቲን ባህርያት ላይ የተመረኮዙ ናቸው. የሚከተሉት ዘዴዎች አንድ ነጠላ የሳይቲኮል ፕሮቲን ለማጣራት አመቺ ናቸው. የሳይቲኮል ፕሮቲን ውስብስቶችን ማጣራት በጣም የተወሳሰበ ሲሆን ብዙውን ጊዜ የተለያዩ ዘዴዎች ተግባራዊ ይደረጋል.

ለፕሮቲን ንፁህ የመጀመሪያ ደረጃዎች

በሴል ውስጥ (ውስጠኛው ክፍል ውስጥ) ፕሮቲን የሚያነፃፀረው የመጀመሪያው ሂደት የታዳጊ ምርትን ማዘጋጀት ነው.

ምርቱ ከሴል ሴቶፖላስሚክ ሁሉም ፕሮቲኖች ውስብስብ ድብልቅ እና የተወሰኑ ተጨማሪ ማክሮዎች, ንጥረ ነገሮች እና ንጥረ ምግቦች በውስጣቸው ይዟል. ጥሬ እጨመረ ለአብዛኞቹ ባዮቴክኖሎጂ ውስጥ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል, ሆኖም ግን ንጽሕናው ችግር ከሆነ, ቀጣዩ የጥገና ደረጃዎች መከተል አለባቸው.

የተዳረጉ የፕሮቲንች ንጥረነገሮች በኬሚካል እና ኢንዛይሞች , በድምፅ ማቀነባበሪያዎች ወይም በፈረንሣይ ፕሬስ አማካኝነት በሴል ሴሊስ የሚመነጩ የተንቀሳቃሽ ሴቲኮችን በመወገዱ ይዘጋጃሉ. ፍርስራሹን በመትረፉ ይወገዳል, ተንከባካቢው መልሶ ይመለሳል. ሴልፋይላር ፕሮቲኖችን (ፍራክላር) የተባይ ፕሮቲን የሚያመነጨው ፕሮቲን በማውጣቱ ብቻ ሴሎችን በማፍለቅ ነው.

ለአንዳንድ የባዮቴክኖሎጂ አፕሊኬሽኖች, የማይነቃነቁ ኢንዛይሞች ፍላጎት አለ. ከፍተኛ የሆነ የሙቀት መጠንን ሳይቀንስ የሚከላከል ኢንዛይሞች አሉ እና ከፍተኛ እንቅስቃሴዎችን በመጠበቅ ላይ ይገኛሉ. የሚፈጥሯቸው ቁሳቁሶች አንዳንድ ጊዜ ጽንፈኞች ናቸው. ሙቀትን ተከላካይ ፕሮቲን ለማጣራት በቀላሉ የሚቀይሩ ዘዴዎች በማቀዝቀዣው ውስጥ የሚገኙትን ሌሎች ፕሮቲኖች በማቃጠል, በመቀጠልም መፍትሄውን በማቀዝቀዝ (በማስነሻው ላይ ያለውን ኢንዛይም ለማሻሻል ወይም ለመቀልበስ እንዲፈቅድ ማድረግ ነው.) የተጣራ ፕሮቲኖች በማጠራቀሚያ (centrifugation) ሊወገዱ ይችላሉ.

መካከለኛ የ Purification ደረጃዎች

ባለፈው ጊዜ ከፕሮቲን ውስጥ ከፕሮቲን ውስጥ ፕሮቲን ለማጣራት የተለመደ የሁለተኛ ደረጃ እርምጃዎች ከፍተኛ የአስክሊካዊ ጥንካሬ (ለምሳሌ የጨው መፍትሄ) ውስጥ በሚገኝ መርዝ ውስጥ ይገኛል. በዊሉሜክሲን ሴኬን ወይም ፕሮፕንሚን ሰልፌት የተሰሩ ጥቃቅን ቅንጣቶችን በመጨመር በችግሩ ውስጥ የሚገኙ ኑክሊክ አሲዶች ይወገዳሉ.

ፕሮቲን እርጥበት በአብዛኛው በአሞኒየም ሰልፌት እንደ ጨው በመጠቀም ይከናወናል.

የተለያዩ ፕሮቲኖች በተለያዩ የአሚሞኒየም ሰልፌት ጠብቀው ይሞላሉ . በአጠቃላይ ከፍተኛ ሞለኪውላዊ ክብደት ያላቸው ፕሮቲኖች በ ammonium sulfate አነስተኛ ቅዝቃዜ ውስጥ ይገኛል. የጨው ዝናብ ብዙውን ጊዜ በጣም የተጣራ ፕሮቲን አያመጣም ነገር ግን በተመጣጠነ ቅልቅል ያልተፈለጉ ፕሮቲኖችን ለማስወገድ እና ናሙናውን ለማተኮር ይረዳል. በምርቱ ውስጥ የሚገኙት ጨው በፖሊሲዝል ቱቦ, በማጣሪያ ወይም በጨርቅ ማስወገጃ ክሮሞግራፊ አማካኝነት በዲጂታል አማካኝነት ይገለላሉ.

ዘመናዊ የባዮቴክ ፕሮቶኮሎች ለትላልቅ የአሰራር ሂደቶች ዝግጁ የሆነ መፍትሄዎችን የሚሰጡ ለንግድ ተብለው ከሚገኙ ብዙ የሽያጭ ስብስቦች ይጠቀማሉ. የፕሮቲን ማጣሪያ ብዙውን ጊዜ ማጣሪያዎችን እና የጃል ማጣሪያ አምዶችን ያዘጋጃል. እርስዎ ማድረግ ያለብዎት መመሪያውን ይከተሉ እና ትክክለኛውን መፍትሄ ትክክለኛውን መጠን እና ትክክለኛውን የጊዜ ርዝመት በአዲስ የሙከራ መለኪያ ውስጥ ሲያስገቡ (የዓምድውን ሌላኛው ጫፍ መውጣት).

• Chromatographic ዘዴዎች በተርጓሚ አምዶች ወይም በራስ ሰር የ HPLC መሣሪያዎች በመጠቀም ሊተገበሩ ይችላሉ. በ HPLC መለየት በኋለ-ፍጥነት, ion-ልውጥ ወይም መጠን-ገላጭ ስልቶች እና በዲዲዮ አደራደር ወይም በሌዘር ቴክኖሎጂ የተገኙ ናሙናዎች ሊከናወኑ ይችላሉ.

  የፕሮቲን ፕሮቲን ምስል እና ምርመራ

  • ዘመናዊ የ Chromium ካርታ (ሲፒአርፒ) ( Reverse-Phase Chromatography) (ሲስተም) በፕሮቲን የተከፋፈሉ ፕሮቲኖች በቫይረሱ ​​ብዛታቸው የተነሳ ይለያያሉ. ይህ ዘዴ በጣም ተፈላጊ ነው, ነገር ግን የኦርጋኒክ መፋቅያዎችን መጠቀም ይጠይቃል. አንዳንድ ፕሮቲኖች በጨረፍታ በቋሚነት ይገለገሉ እና በ RPC ጊዜ ተግባራዊነት ያጣሉ. ስለዚህ ይህ ዘዴ ለሁሉም አፕሊኬሽኖች አይመከርም, በተለይ የሚፈለገው ፕሮቲን እንቅስቃሴን ለመያዝ አስፈላጊ ከሆነ.
  • ኢንስ-ጋይዮግራፊካዊ አቀራረብ በፕሮፌሽናል ላይ የተመሠረተ ፕሮቲን ለመለየት ይጠቅሳል. አምዶች ለ anion exchange ወይም cation exchange. የአኖዮን ልውውጥ አምዶች የንጥል ክፍፍል ያላቸው እና አሉታዊ ውስብስብ የፕሮቲን ውህዶችን የሚስቡትን አወንታዊ ክፍያዎች ይዘዋል. የኬንዚን ልውውጥ አምዶች የተዋሀዱ ፕሮቲኖችን የሚስቡ በተቃራኒው የተሞሉ ድቦች ናቸው. የታለመው የፕሮቲን (ዎች) ፕሮቲን (ስኬት) የሚደረገው በአምዱ ውስጥ ያለውን የ pH መጠን በመለወጥ ነው.
  • በካ ክራቶግራፊ አምድ ውስጥ ትላልቅ ሞለኪውሎች በማገናኛው ፖሊመር አማካኝነት በፍጥነት መጓዝ ስለማይችሉ መጠን-ዘካት ( ቻይልድ ማቲ ማኮጊስ ) ትናንሽ ፕሮቲኖችን ይለያል. ትላልቅ ፕሮቲኖች ከፖምፐረር አፈር ውስጥ እምብዛም አይሆኑም እንዲሁም አነስተኛ ፕሮቲኖች ይሰራሉ ​​እንዲሁም በቀላል መንገድ ቀጥተኛ መስመር በኩል በክሮፎግራፊክ አምድ በኩል ለመጓጓዝ ብዙ ጊዜ ይወስዳሉ. Eluate በህንጻው ላይ ተመርኩዞ ፕሮቲን በሚለቁ ተከታታይ ቱቦዎች ውስጥ ይሰበሰባል. የአሸዋ ማጣሪያው መርዛማ የሆነው ፕሮቲን በአነስተኛ ማጣሪያ ውስጥ ከተሰበሰበው በኋላ ወደ አምድ ከተጨመረ በኋላ የፕሮሰክቱ ናሙና ነው. በተመሳሳይ ወጪ ቆጣቢ ውጤት ምክንያት ከፍተኛ መጠን ባላቸው ፕሮቲኖች ውስጥ ጥቅም ላይ ሊውሉ ይችላሉ.
  • ተለዋዋጭ ክሮምቲግራፊ "ለማጥለጥ" ወይም የፕሮቲን-ማጣሪያ ሂደቱን ለማጠናቀቅ ጠቃሚ መሣሪያ ነው. በክሮሞግራፊክ አምድ ውስጥ ያሉት መቁጠሪያዎች ግብ ላይ ለሚገኙት ግብታዊ ተረቶች (ሊስፕስ) ተብሎ በተሰሩ እግዶች ላይ የተገናኙ ናቸው. ከዚያም ነፃ የፕሮቲን ፕሮቲን (ፈሳሽ) የያዘውን ፈሳሽ በማጣራት ከአምዱ ውስጥ ይወገዳል. ይህ ዘዴ ከሌሎች ቴክኒኮች ጋር ሲነጻጸር ንጹህ ውጤቶችን እና ከፍተኛውን ክንውን ያቀርባል.
• SDS-PAGE በፕሮቲኖች ውስጥ የተከማቸ ከፍተኛ የኔትዎርክ አሉታዊ ክፍፍል (SDS) (SDOD) (SDOD) (ሶዲዲድ dodecyl sulfate) መኖሩን ያካተተ ፖሊacrylamide gel electrophoresis ነው. የሁሉም ፕሮቲኖች ዋጋዎች እኩል ናቸው, ይህ ዘዴ በአጠቃላይ በመላው መጠናቸው ይለያል. SDS-PAGE ብዙ ጊዜ በተከታታይ ከደረሱ በኋላ የፕሮቲኑን ንጹህ ለመሞከር ያገለግላል. ያልተፈለጉ ፕሮቲኖች ቀስ በቀስ ከቅዝቁቱ ውስጥ እንዲወገዱ ሲደረግ, የተፈለገውን ፕሮቲን የሚወክለው አንድ ቡድን ብቻ ​​እስኪቀንስ ድረስ በ SDS-PAGE ግርግ የሚታዩ የባንዶች ብዛት ይቀንሳል.
• Immunoblotting በኬሚካዊ አቀማመጥ (ጥቃቅን ክሮሞግራም) ጥምረት የተተገበረ የፕሮቲን ምስል የመመልከቻ ዘዴ ነው. ለአንድ የተወሰነ ፕሮቲን ፀረ እንግዳ አካላት (ኤች.አር.ቲ. የታለመው ፕሮቲን በአምዱ ውስጥ ይቀመጣል, ከዚያም ዓምዱን በጨው ክምችት ወይም በሌሎች ወኪሎች በመጠጣት ይወሰዳል. ከተቀረው ድብልቅ ከተለቀቀ በኋላ የፕሮቲን ፕሮቲን ለመለየት ከሬዲዮአክቲቭ ወይም ከቀይ መላጥያዎች ጋር የተገናኙ ፀረ-ተባይ ንጥረ ነገሮች.

ምንጮች:

ዘቢይጂ 1988 ዓ.ም. ባዮኬሚስትሪ, 2 ኛ እትም. ማክሚላን ህትመት ኩባንያ, ኒው ዮርክ, ኒው ዮርክ, ዩኤስኤ.

Amersham Pharmacia Biotech. 1999 ፕሮቲን የማጣቀሻ መጽሀፍ, እትም አ. Amersham Pharmacia Biotech Inc. ኒው ጀርሲ, አሜሪካ. ዌብሳይት.